Cupriavidus necator autotróf módon való növesztéséhez összeállítottunk egy egyszerű rázatott lombikos kísérletet, ahol hidrogén/szén-dioxid/oxigén/nitrogén atmoszféra alatt tenyészthetjük a sejteket. Egy 100mL-es Erlenmeyer lombik, a szája szilikon dugóval lezárva, ez egy tűvel átszúrva, 0.2μm szűrővel ellátva alkotja a kezdetleges bioreaktorunkat. Mivel a CO₂ a Calvin cikluson keresztül szerves anyaggá konvertálódik, a molekuláris hidrogén pedig vízzé oxidálódik, ezért egy térfogat csökkenési reakcióról beszélünk, amit a következő Ishizaki és Tanaka által meghatározott egyenlettel írhatunk fel, ebből, egy molekulatömeget is tudunk számolni:

21.36 H₂ + 6.21 0₂ + 4.09 CO₂ + 0.76 NH₃ → C_4.09H_7.13O_1.89N_0.76 + 18.7 H₂0           [1]

A minimál tápoldat felett, a lombikban egy túlnyomásos gázteret hozunk létre, ami a reakció előrehaladtával folyamatosan csökkenni fog. A hidrogén mérete miatt egy sima lufi erre a célra nem alkalmas, mert a gáz nagyon gyorsan kidiffundál belőle, erre a célra egy vastag falú labda belsőt érdemes használni. A gázkeveréket egy ballonba  töltjük bele, így a pontos koncentrációt nehéz beállítani, de térfogatarányosan úgy kell a gázokat betölteni, hogy az arányuk körülbelül 85 rész hidrogén : 5 rész CO₂ : 10 rész levegő legyen. Ezzel az összeállítással végeztük a következő kísérlet sorozatot. 

1. Ábra

2. Ábra

3. Ábra

A vizsgálandó törzset Cupriavidus necator DSM 428 (Strain designation: H 16, H16) a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH-tól fagyasztva szárított formában rendeltünk, amit nutrien agar-on regeneráltunk.

Az ampulla tartalmát 500-500 μL LB médiumban elszuszpendáltuk, majd fél óra állás után 10-10 mL LB médiumba oltottuk, 24 órát rázattuk 30^oC-on, majd 50%-os glicerines oldattal 1-1 arányban kevertük, ezután -80^oC-os hűtőben 2 mL-es Eppendorf csövekben letároltuk. Az OD: 0,8-1 között van →working cell bank (WCB1).

20 mL MCN1 médiumot 30 g/L szénforrás mellett 1 mL WCB1 letárolt tenyészettel inokuláltunk, két hét inkubációt követően (30 ^oC, 300 rpm) ennek 18mL-ét  OD: 24.44 értéknél lecentrifugáltunk, kétszer mostuk MCN1 (fruktóz nélkül) tápoldattal, ismét lecentrifugáltuk, majd 16mL tápoldattal szuszpendáltuk (OD: 24). Ennek 1mL-ét használtuk a 18mL MCN1 (fruktóz nélkül) tápoldat beoltására. Továbbiakban leoltottunk még két lombikot, amik 10g/L fruktóz szénforrást tartalmaztak, valamint egy vakot, ami sem szénforrást, sem gázelegyet nem tartalmazott. A szénforrást és gézelegyet tartalmazó lombikban nem tapasztaltunk növekedést. Szerves szénforráson egy hosszabb Lag fázis után (40-70h) a tenyészet a gyorsulási, majd az exponenciális szakaszba lépett,  az egyik esetben 165 óra után a másiknál 237 óránál érte el a maximális OD értéket, ami 23 és 22.7 volt. A 150 óra után a hanyatló fázisba léptek. 

Szén-dioxidon és hidrogénen egy még hosszabb Lag fázis (100 óra) után lépett a növekedési fázisba a tenyészet, ami a 332 óráig folyamatos növekedésben volt, a maximális OD: 14.1. Maximális növekedési rátát 0,0206 h^-1 a 93 és a 165 óra között érte el. Ez szerves szénforráson, rázatott lombikban maximálisan 0.0959 h^-1 volt. Fermentorban, jól levegőztetett körülmények között a  0.159 h^-1 értéket is elérte [2020-09-15 Cupriavidus necator]. 

A tenyészetet 332.17 óra után lecentrifugáltuk, a felülúszó 15 mL lett. A kezdeti pH 7.41 a fermentáció végére pH 6.51-re csökkent. A mintavételi veszteség 2,2 mL, így a kiindulási térfogathoz (19 mL) viszonyítva 1.8 mL párolgási veszteséggel kell számolnunk. Sűrűséget és száraz tömeget is mértünk belőle, ez az alábbi táblázatban látszik.

14.1 OD értékhez 3.5 g/L száraz tömeg tartozik. A sűrűsége 1.0111 g/L.

Eppendorf m	Epp+2mLminta m	Epp+sejt m	Folyadék tömeg	Száraz tömeg	Sűrűség [g/cm]	Konc. [g/L]
1.0785	3.0999	1.0854	2.0214	0.0069	1.0107	3.45
1.0652	3.1082	1.0722	2.0430	0.0070	1.0215	3.50
1.0651	3.0881	1.0722	2.0230	0.0071	1.0115	3.55

HPLC mérés alapján szerves savak, szénhidrátok nem voltak kimutatható mennyiségben a mintában, ezzel a módszerrel mérve^*. A három látható csúcs a médiumból és a futtató elegyből jön. 

Ebből a tenyészetből kiindulva indítottunk egy következő rázatott lombikos kísérletet 3 párhuzamossal + egy vak. MCN2 (fruktóz nélkül) tápoldatot használtunk, dupla annyi (NH₄)₂SO₄ és többféle nyomelem oldattal kiegészítve. 20-20mL, 0,5mL-el inokulálva. A kezdeti OD: 0,23. Az előző kísérlethez képest, itt annyiban tértünk el, hogy a gázelegyet nem egy ballonban vegyítettük össze. Az egyik ballonba töltöttük a levegőt, és a szén-dioxidot, a másikba a tiszta hidrogént. A gázokat egy gyors csatlakozós 5-ös elosztó 1-es és 5-ös részére csatlakoztattuk, 2,3,4-es portok vezették a gázokat a lombikokba.  

x3

Az előző kísérlethez képest itt még hosszabb Lag fázist tapasztaltunk, ami 140 óra volt, a fermentáció kezdetén a sejtszám is csökkent. 300 óráig hasonló növekedési intenzitást mutattak, majd az SF1,3 lombikban ellaposodott a növekedési görbe. Mivel 3 párhuzamosról van szó, így a növekedésben mutatkozó jelentős különbség a gázelegy egyenlőtlen elosztása miatt, esetleg a steril szűrők átjárhatóságának különbségében keresendő. Az egyik ballont hidrogénnel, a másikat levegő és szén-dioxid elegyével töltöttük, elkerülve a robbanó elegy képződését. Azonban, ahogy csatlakoztattuk az 5-ös (CO₂/Air), és 1-es (H₂) portokhoz, a ballonokat, a kisebb (Air/CO₂) ballonból a gáz egy része átnyomódott a nagyobb, hidrogént tartalmazó ballonba (Elastic Hysteresis). AZ 5-ös portnál fellépő nagyobb nyomás, gátolhatta a a hidrogén bejutását a lombikba, így a lassú növekedésnek talán ez is lehetett a magyarázata.  

A legnagyobb növekedési rátát (0.0314 h^-1, 0.0368 h^-1, 0.0304 h^-1) a fermentáció 141-188 óra közötti szakaszában értük el, ekkor az OD < 1. 

A korábbiaknál itt egy még hosszabb Lag fázist (130h +) tapasztaltunk. 335h után SF1 és SF3 esetében a fermentáció stacionárius fázisba lépett, SF2 esetében ez a 427h után következett be. Ezután minimális növekedés volt tapasztalható egészen 530h-ig, majd az 530h után jelentős növekedés volt megfigyelhető, 529h → 598h μ = 0.0138h^-1, G = 50.4h, n = 1.4. 529h-nál sűrűség és szárazanyag tartalom mérést végeztünk, ezzel 10mL folyadékot eltávolítottunk az Erlenmeyer lombikból. ρ = 1.021 g/cm³; DCM = 4.4 g/L; OD = 12.3. 

Eppendorf m	Epp+2mLminta m	Epp+sejt m	Folyadék tömeg	Száraz tömeg	Sűrűség [g/cm]
1.0812	3.074	1.09	1.9928	0.9964	0.0088
1.0742	3.1241	1.0831	2.0499	1.02495	0.0089
1.0836	3.1223	1.0924	2.0387	1.01935	0.0088
0.9898	3.0269	0.9985	2.0371	1.01855	0.0087

Ezzel 50%-al csökkentettük a teljes térfogatot, az utolsó 69h-ban jelentős növekedésnek indult a tenyészet, az 598. órában a pH 5.85-re csökkent, a maradék fermentléből ismét sűrűség és szárazanyag tartalom mérést végeztünk. 

Eppendorf m	Epp+2mLminta m	Epp+sejt m	Folyadék tömeg	Száraz tömeg	Sűrűség [g/cm]
1.0701	3.0787	1.0842	2.0086	1.0043	0.0141
1.0741	3.1273	1.0887	2.0532	1.0266	0.0146
0.9923	3.0303	1.0069	2.038	1.019	0.0146

ρ = 1.017 g/cm³; DCM = 5.41 g/L; OD = 31.8. 

x2

Az SF2 rázatott lombikos tenyészet (529h, OD:12.3) 1-1 mL-ével egy következő kísérletet indítottunk, MCN2 tápoldatban két párhuzamossal, az előbbivel megegyező kísérleti körülmények között. 

^* HPLC with a refrative index detection. Separation was achieved on BioRad (Hercules, CA, USA) Aminex HPX-87H (300 × 7.8 mm) column equipped with Micro-Guard Cation H⁺ Refill Cartridge (30 × 4.6 mm) guard column heated at 65 °C, using 5 mmol/L sulphuric acid 0.5 mL/min.

Hivatkozások

[1] Batch Culture of Alcaligenes eutrophus ATCC 17697 T Using Recycled Gas Closed Circuit Culture System; AYAAKI ISHIZAKI AND KENJI TANAKA; JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING Vol. 69, No. 3, 170-174. 1990. [Letöltés]